זיהום אנדופיט (Endophyte) ב[1]Perennial ryegrass- מקטין את רגישות הזחל השחור (Black cutworm) לנמטודה אנטומופתוגנית
בריאן א.קנקל (Brian A.Kunkel) ופרווינדר ס.גרוול (Parwinder S.Grewal).
מילות מפתח: Agrotis ipsilon, Steinernema carpocapsae, בקרה ביולוגית (\הדברה ביולוגית, biological control), Neotyphodium lolii, Lepidoptera (ממשפחת הפרפריים), Noctuidae, השפעות מולטי-תזונתיות (multitrophic effects)
תקציר:
ה- P. ryegrass, Lolium perenne) ) יוצר יחסים סימביוטיים עם Neotyphodium lolii, פטרייה היוצרת אלקלואידים (תרכובות חנקן). יחסים אלו יוצרים יתרון בעבור הנשא במערכות גידולים על ידי הגדלת העמידות בבצורת, מחלות ובפני אוכלי עשב. הזחל השחור, Agrotis ipsilon, היא מבין מיני החרקים הבודדים היכולים להיזון ולהתפתח על p.ryegrass אנדופיטי (הנושא טפיל). חרקים מסוימים יכולים להשתמש ברכיבים משניים של צמחים בכדי להתגונן בפני טורפים, לפיכך אנו מניחים כי הזחל שניזון מהעשב האנדופיטי יציג הגנה טובה יותר בפני הנמטודה טפילת הפנים (endoparasitic nematode, Steinernema carpocapasae) הקטלנית. ניסויי מעבדה עם חרקים בשלבי ביניים רביעיים וחמישיים (4-5th instars)[2] תומכים בהיפותיזה ש A.ipsilon הניזון מעשב שמקורו בחלקות שדה עם שכיחות גדולה (גבוה מ-90%) של p.ryegrass נגוע אנדופיטית רגיש פחות לנמטודות אנטומופתוגניות מאשר זחלים שניזונו מעשב עם שיעור נמוך או כלל ללא מקרים אנדופיטים. בדיקות מעבדה הראו שיעורי תמותה דומים לאחר 48 שעות. אולם מחקרי שדה הראו רגישות מופחתת ל S.carpocapasae כאשר זחלים הוגבלו לאזורים של עשב אנדופיטי (בשיעור של מעל ל-75%). חרקים מוקדמים (שלב ביניים שני-שלישי) שניזונו מעשב חופשי מאנדופיטים סבלו משיעור תמותה כללי גבוה יותר בכל ריכוזי הנמטודות מאשר חרקים בשלב הביניים רביעי- חמישי שניזונו באופן דומה. חרקים בשלבי ביניים מוקדמים (שני-שלישי) היו רגישים באופן שווה לנמטודות ללא קשר למקור המזון. התוצאות מראות כי האנדוסימביוטיות של עשבים יכולה להשפיע על הביולוגיה של אויביהם הטבעיים של חרקים אוכלי עשב.
הקדמה
כאשר מפתחים צמחים הגנות חדשות בכדי להבריח חרקים אוכלי עשב (insect herbivores), עשוי הרווח מההתאמה לדרבן פרץ הקרנה סביבתית (1Dobler, 200). זני עשבים מסויימים ממשפחת Poaceae עשויים ליצור סימביוזה עם הפטרייה האנדופיטית, Neotyphodium spp (Siegel et al., 1987). התועלת באירוח הפטרייה האנדופיטית נובעת בעיקר מרכישת אלקלואידי הגנה חדשה המספקים עמידות בפני אוכלי עשב (Breen, 1994 ; Porter, 1994). עשבים הנושאים את האנדופיטית הפטרייתיים לבסוף שולטים על קהילת הצמחים (Clay, 1997).
חרקים המתגברים על הגנות צמחים חדשות עשויים להשתלט על המשאבים הבלתי מנוצלים חופשיים מתחרות ולהקרין בהצלחה על זני צמחים חדשים מתבססים (Dobler,2001). ארליך ורייבן (Ehrlich & Raven) (1964) התייחסו למרוץ אבולוציוני זה כאבולוציה משותפת (co-evolution) בין צמחים לחרקים אוכלי צמחים. הזחל השחור (black cutworm) Hufnagel Agrotis ipsilon (לפידופטרה, משפחת העשיים) יכולים להיזון ולהשלים את התפתחותם מ p.ryegrass נגוע באנדופיטים (Williamson&Potter, 1997a) שבעבור מגוון חרקים אחר הינו רעיל ביותר (7Breen, 1994 ; Clay, 199). יכולתם יוצאת הדופן של זן רב מזוני (polyphagous) זה לסבול או לנטרל את רעילות האלקלואידים מדגימה את הפוטנציאל של חרקים אוכלי עשב להתגבר על הגנות צמחים ולהשפיע על מבנה קהילת הצמחים.
Omacini at al. (2001) דיווחו כי לצמחים אנדופיטיים יש את הפוטנציאל לשנות את דינמיקת רשת-המזון. הם מצאו כי Neotyphodium מקטין את שיעור ההשרדות של כנימות פרזיטוידיות (aphid parasitoids) והיפר-פרזיטוידים ( hyperparasitoids) הקשורים אליהן. ברקר ואדיסון (Barker & Addison) (1996) הדגימו שהגבלת תנועה של החדקונית Listronotus bonariensis (kuschel) לאזורי p.ryegrass נגוע אנדופיטית הובילה להתפתחות מפגרת של הפרזיט Microctonus hyperodae. השפעות מולטי- תזונתיות (multitrophic) אלו הן צפויות כאשר שרידותם והתפתחותם של אוכלי-עשב ראשוניים מושפעת בידי התזונה הגרוע והרעילות של המטבוליטים המשניים כתוצאה מסימביוזת הצמח-פטרייה. אולם, ישנם חרקים אוכלי-עשב האוכלים צמחים עם מרכיבים שניוניים רעילים או מרתיעים ומשלבים מרכיבים אלו אל תוך הגנותיהם שלהם (Brower, 1969 ; Brown, 1984). לפיכך ההיפותיזה שלנו היא כי זחלי A.ipsilon הניזונים מ p.ryegrass אנדופיטי יציגו הגנה גדולה יותר כנגד אויביהם הטבעיים.
בחקירה זו אנו מדגימים את הרכישה של עמידות מוגברת בידי זחלי A.ipsilon הניזונים מ p.ryegrass הנגוע באנדופיטים כנגד זיהומי נמטודה אנטומופתוגנית (entomopathogenic nematode)
בעלת מגוון רחב במיוחד של נשאים. אנו בחרנו ב Steinernema carpocapasae
A.ipsilonבעבור חקירה זו מכיוון שהוא אנדופזריט קטלני של (Rhabditida: Steinernematidae)
ומשמש בשליטה ביולוגית על זן זה (Grewal & Georgis, 1998). השלב השלישי המדבק של s.carpocapasae הצעירים תוקף חרקים מתאימים על או בתוך הקרקע (Campbell & Gaugler, 1993 ; Grewal at al., 1997), הוא פולש דרך פתחי גוף טבעיים ומשחרר בקטריה סימביוטית Xenorhabdus nematophilus Thomas and Poinar, אל תוך ה hemocoel. הזיהום הבקטריאלי לרוב הורג את הנשא בתוך 2-3 ימים (Kaya & Gaugler, 1993). הצעירים המזהמים ניזונים מבקטריה מתרבה ותוכן הגוף של החרק ומתרבים. לאחר דור אחד עד שלוש הדור הבא של צעירים מזהמים נוצר ועוזב את הגווייה בכדי לאתר נשאים חדשים.
ראשית, מדדנו את השפעות p.ryegrass, Lolium perenna L. (Poaceae), על צבירת משקל וזמן ההפיכה לגולם (pupation) של A.ipsilon. אז קבענו את הבדלי הרגישות של חרקי A.ipsilon בשלבי ביניים שניים ורביעיים (2nd and 4th instar) לs.carpocapasae לאחר האכלת הזחל ב p.ryegrass המכיל רמות שונות של אנדופיט בניסויי מעבדה. כמו כן הערכנו את השפעת מינון נמטודה על גם חרקים בשלבי ביניים שניים ושלישיים וגם רביעיים וחמישיים שניזונו מ p.ryegrass חופשי מאנדופיט. הרגישות של חרקי A.ipsilon הרביעיים שניזונו מ p.ryegrass אנדופיטי או לא אנדופיטי הוערכה גם בשטח.
שיטות וחומרים
עשבים, חרקים ונמטודות
p.ryegrass (p.perenne) שימש ללימוד השפעות האנדופיט N.lolli על פגיעות זחל שחור לנמטודות אנטומופתוגניות. חלקות שדה זרועות בתערובות של p.ryegrass 'Repel II' (זרעי 'לופט' בע"מ, ווילמינגטון, אוהיו) הכילו אחד משלושת הרמות של צמחי עשב עם זיהום אנדופיטי: גבוה (מעל ל90% מהנבטים נגועים), בינוני (40%-60% מהנבטים נגועים) ונמוך (פחות מ20% מהנבטים נגועים). רמות האנדופיט נקבעו מראש או ע"י הכתמת חומר הצמח או ע"י טביעת רקמה מותאמת בבחינת הכתמה-אימיונית (modified tissue print immunoblot assay) (Saha at el., 1998 ; Gwinn et al., 1991). גזירי עלים נאספו במהלך יולי-ספטמבר 1999 לשימוש בבחינות (assays) עם זחלים ילודים. p.ryegrass חופשי מאנדופיט הורבה בשיבוט מצמחים קיימים שטופלו באופן חוזר עם פרופיקונזול ((propiconazole בשנה שקדמה. ל p.ryegrass ‘Repel II’ נגוע באנדוטיפ שגודל בחממה היה שיעור הדבקה של כ75% או גדול מ95%.
דוגמיות גזירי עשב נלקחו מה p.ryegrass שגודל בחממה בזמן שזחלים גודלו בעבור שימוש בניסויים. דוגמיות אלו עובדו בכדי לוודא את נוכחותם של אלקלואדים המופקים מפטרייה בזמן שהזחלים ניזונו מהצמחים תוך שימוש בשיטה מבוססת HPLC (Salminen & Grewal, 2001). דוגמיות אלו אישרו את התוצאות מההכתמה (staining) או הבחינה אימיונית (immuno-assays) שאכן הפטרייה נוכחת לאורך הניסויים. הנמטודות, S. carpocapsae, כולן מסוננות, גודלו משלב הביניים האחרון של Galleria mellonella L היו בנות יותר משלושה שבועות (Kaya & Stock, 1997) ואוכסנו ב .24°C ביצי ה A. ipsilon נלקחו ממבוגרים שגודלו במושבות מעבדה ב USDA-ARSבמדינת איווה. בעבור כל הניסויים הואכלו זחלי A. ipsilon מגזירי עשב המכילים את הרמות המתאימות של זיהום אנדופיט לניסויי היחסי ונשמרו באינקובטור ב25°C, מחזור (cycle) L14:D10. בניסויי מעבדה נחשבו זחלי A. ipsilon מתים במקרה בו לא הראו כל תגובה לדחיפות עם מכחול. אנו מגדירים את רגישות (\פגיעות) הזחל ל S. carpocapsae בתור הסבירות שחרק הבא במגע עם הנמטודות יהפוך נגוע וימות.
השפעות אנדופיט על התפתחות A. ipsilon
השיטות בהן השתמשנו בכדי לגדל A. ipsilon היו דומות לאלו של וויליאמסון ופוטר (Williamson & Potter) (a1997) ובהן 10 ילודים (neonate) הונחו בתוך צלחת פטרי של 9 ס"מ והואכלו בעשב נגוע באנדופיט או חופשי מאנדופיט למשך שבוע אחד. לאחר שזחלים מבודדים נשקלו בגיל שבוע, הזחלים הופרדו בכדי למנוע קניבליזם, והועברו ביחידות לכוסות פלסטיק בגודל 5X8 ס"מ עם גזירי עשב יחסיים. זחלים נשקלו בגילאי 16,20,24,28 ו32 ימים וסך הימים הכולל שנדרש למעבר לגולם היה 40 יום. אוכל סופק בחופשיות (ad libitum) בכל יום או לפי הצורך.
השפעת עשב נגוע-אנדופיט המגודל בשדה על רגישות A. ipsilon בשלב הביניים הרביעי לנמטודות.
הניסוי נערך בכדי לקבוע אם A. ipsilon הניזון מעשב אנדופיטי יציג שיעור תמותה נמוך יותר כהשפעה מנמטודות אנטומופתוגניות. זחלים חולקו לקבוצות ובאופן אקראי קיבלו רמה (גבוה, בינוני או נמוך) של p.ryegrass אנדופיטי מחלקות השדה. זחלים בכל קבוצה הואכלו גזירי עשב המכילים את הרמה המתאימה של זיהום אנדופיט במשך שבועיים לפני ששימשו לניסוי. לפני החשיפה לנמטודות נשקלו זחלים מכל קבוצה בכדי לקבוע אם גודל משפיע של רגישות לנמטודות. חמישה חרקים בשלב הביניים הרביעי נחשפו ל300 נמטודות בכל צלחת פטרי (קוטר 9.0 ס"מ) עם ארבע העתקים. בקרים לניסוי זה הורכבו מזחלים שניזונו מכל רמות p.ryegrass האנדופיטי (גבוה, בינוני, נמוך) אך לא הוספו להם נמטודות. שיעור תמותה נבדק ב 20, 24, 28 ו42 שעות לאחר החשיפה לנמטודות.
ניסויי מינון
ניסויים אלו נערכו בכדי לקבוע את השפעת מינון הנמטודות על חרקים בשלב הביניים שני-שלישי ורביעי-חמישי. שיערנו כי חרקים בשלב הביניים שני-שלישי ימותו מהר יותר ויציגו שיעור תמותה כולל גדול יותר במינונים השונים בהשוואה לחרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי. זחלים הואכלו גזירי עשב חופשיים מאנדופיטים שגודלו בחממה עד שהיו בשלב הביניים שני-שלישי או רביעי-חמישי. מינוני נמטודות ששימשו לניסוי היו 0, 10, 20, ו-40 צעירים (juveniles) זיהומיים בעבור כל חרק בכל צלחת פטרי. כל מינון ניתן לשתים (שלב ביניים שני-שלששי) או שלוש (שלב ביניים רביעי-חמישי) צלחות פטרי בעבור כל העתק. ארבעה העתקים נבחנו כנגד חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי ושלושה העתקים בחנו את ההשפעות כנגד חרקים בשלב הביניים שני-שלישי. מנת 0 הנמטודות שימשה כבקר שלנו. חמישה זחלים הוספו לכל צלחת פטרי כשעה לאחר הכנסת הנמטודות. שיעורי תמותה נמדדו לאחר 16 שעות וכל 4 שעות לאחר מכן עד ל44 שעות לאחר החשיפה.
השפעות עשב שגודל בחממה על רגישות חרקיA. ipsilon בשלב הביניים רביעי-חמישי לנמטודות
הניסוי בחן את רגישות חרקי A. ipsilon בשלב הביניים רביעי-חמישי ל S. carpocapsaeכאשר הזחלים ניזונו מגזירי עשב מאחת משתי רמות זיהום האנדופיט: ללא אנדופיט ומעל ל95% הדבקה. ילודים נפרדים הונחו בצלחות פטרי של 5 ס"מ והואכלו גזירי עשב אנדופיטיים או חופשיים מאנדופיט למשך שלושה שבועות. זחלי Agrotis ipsilonנשקלו באופן אינבידואלי ומוינו לקבוצות גודל. הזחלים בשלב הביניים הרביעי בעלי משקל דומה נבחרו משתי קבוצות התזונה לשם שימוש בניסוי. ריכוז נמטודות של 35 צעירים זיהומיים לכל זחל (175 נמטודות\צלחת) הונחו על נייר פילטר בצלחות פטרי של 9 ס"מ שעתיים לפני הכנסת הזחל. חמישה זחלים הוכנסו לכל צלחת עם גזירי עשב. היו שתי צלחות לכל העתק ושלושה העתקים (30 זחלים\אפיק טיפול n =). אפיקי הטיפול היו: זחלים שניזונו מעשב אנדופטי (ללא נמטודות), זחלים שניזונו מעשב חופשי מאנדופיטים (ללא נמטודות), זחלים שניזונו מעשה אנדופיטי ונחשפו לנמטודות וזחלים שניזונו מעשב חופשי מאנדופיטים ונחשפו לנמטודות. שיעור התמותה נמדד לאחר 16 שעות וכל ארבע שעות לאחר מכן עד שאובחן שיעור תמותה גדול מ- 80%. הזחלים שמתו במהלך ניסוי זה נשמרו ב 5°C ולאחר 72 שעות ב25°C בכדי להאט את התפתחות הנמטודות. זחלים מתים מכל אפיקי הטיפול נותחו בכדי לברר נוכחות של נמטודות בוגרות. נמטודות בוגרות נספרו בגופות ויוצגו כמספר נמטודות שחדרו בעבור כל זחל.
בשלב הביניים שני-שלישי לנמטודות A. ipsilon השפעות אנדופיט על רגישות חרקי
S. carpocapsae ניסוי זה בחן את השפעת עשב נגוע אנדופיט על רגישות חרקים בשלב ביניים מוקדם ל-
שני ניסיונות של חשיפת חרקים בשלב ביניים מוקדם ל S. carpocapsae נערכו בכדי להתייחס למספר ההעתקים הנמוך בכל ניסיון נפרד. ילודים הואכלו עשב אנדופיטי (75% נגוע) או לא אנדופיטי (0% נגוע) מהחממה, ונשמר ב 25°Cבמחזור L14:D10. כל צלחת פטרי 9 ס"מ הכילה ארבע A. ipsilon בשלב הביניים שני-שלישי והיו שלוש צלחות בכל העתק וארבעה העתקים של ניסוי זה (48 זחלים בכל אפיק טיפולn = ). הנמטודות הוכנסו בשיעור של 80 צעירים זיהומיים בכל צלחת. הבקרים הורכבו מארבע זחלים שלהם סופק p.ryegrass אנדופיטי או לא אנדופיטי בצלחות פטרי ולא נחשפו לנמטודות. שיעורי תמותה נמדדו לאחר 16 שעות וכל ארבע שעות לאחר מכן עד ל48 שעות לאחר החשיפה.
ערכנו ניסוי זה שוב עם אותו ריכוז נמטודות בכדי לוודא את העדר השפעות של עשב אנדופיטי על רגישות חרקים בשלב ביניים מוקדם ל S. carpocapsae אך בפעם זו כללנו גם שקילת הזחלים בתור משתנה. זחלים האוכלו עשב אנדופיטי (מעל ל95% נגוע) או לא-אנדופיטי כמקודם ושיעור התמותה נבדק בנקודות זמן זהות לאחר החשיפה. נתונים מניסוי זה לא שולבו עם הניסוי הקודם מכיוון שרמת ההדבקה האנדופיטית הייתה גדולה יותר ואנו רצינו לקבוע אם משקל הוא משתנה משמעותי לרגישות הזחלים. זחלים שניזונו מגזירי עשב אנדופיטים או ללא אנדופיטים נשקלו באופן אינדיבידואלי וחולקו לקבוצות משקל. היו חמישה חרקים בשלב הביניים שני-שלישי בכל צלחת פטרי 9 ס"מ ו100 צעירים זיהומיים בכל צלחת. נעשה שימוש בזחלים במשקל דומה בעבור כל העתק. היו שתי צלחות בעבור כל העתק וארבעה העתקים לניסוי (40 זחלים לכל אפיק טיפולn = ). כבקרים שימשו הזחלים שהואכלו עשב יחסי אך לא נחשפו לנמטודות.
ניסוי שדה
חלקות עשב ובהן עשב נגוע-אנדופיטית (כ75%) או חופשי מאנדופיט שימשו בכדי לקבוע האם רגישות A. ipsilon לנמטודות הושפעה באופן דומה ע"י האנדופיט בשדה. בניסוי זה הובאו זחלים ממושבת מעבדה (AgroSciences, אינדיאנפוליס, אינדיאנה) שם הם ניזונו באופן מלאכותי עד לשלב הביניים שני-שלישי. צילינדרים (בקוטר 21 ס"מ) הגבילו A. ipsilon בשלב הביניים שני-שלישי לאזורים של p.ryegrass נגוע אנדופיטית או חופשי מאנדופיט. עשרה זחלים הונחו בכל צילינדר ופס וזלין של 2.5 ס"מ הונח סביב השפה של כל צילינדר בכדי למנוע מהזחלים לצאת. רשת עדינה הונחה מעל כל צילינדר בכדי למנוע תעופה מוקדמת (avian predation). הזחלים ניזונו בתוך הצילינדרים במשך 10 ימים לפני הכנסת הנמטודות בכדי להגיע לשלבי הביניים רביעי-שישי. הנמטודות הוכנסו בריכוז של 0.5 מיליארד צעירים זיהומיים בכל אקר (כ4,000 מ"ר). לאחר 36-38 שעות לאחר הכנסת הנמטודות לעשב הנותר נקצץ קרוב לקרקע והגזירים נבדקו לזחלים בטרם הושלכו. הקרקע הוספגה(30 ml/7.6 l) בדטרגנט Joy® (Proctor and Gamble, סינסנטי אוהיו) בכדי לגרום לזחלים לעלות לפני הקרקע (Niemczyk & Shetlar, 2000). הזחלים שלא עלו לפני הקרקע נחשבו כמתים. בדיקות בקרה היו צילינדרים באותו הגודל, מספר זחלים, עשב אנדופיטי או לא אנדופיטי ואותו פרק זמן בשדה אך ללא הכנסת נמטודות.
ניתוח נתונים
נתונים נותחו בשימוש בחבילת התוכנה .(Statsoft, 1999) STATISTICA®נתונים על תזונת זחלים והשפעות אנדופיט על רגישות A. ipsilon נותחו ע"י ניתוח מידות חוזר רב מידות של משתנים ((Multivariate Repeated Measures Analysis of Variance .(ANOVA) הנתונים הושמו בארכ-סינוס שורש ריבועי לפני הניתוח כאמצעי חזרה (ANOVA (Repeated Measures. שאר ניסויי המעבדה נותחו בעזרת אמצעי חזרה בעל משתנה אחד (Univariate Repeated Measures) ANOVA ונעשה שימוש בגרינהאוס- גייסר ((Greenhouse– Geisser במרווח חופש מותאם וערכי P (P-values) כאשר הנתונים לא תאמו את הנחת הכדוריות (assumptions of sphericity). תוצאות השדה נותחו כ ANOVA ושיעור תמותה תוקן עם נוסחת אבוט (Abbott’s formula (Abbott, 1925)). נעשתה הערכת משמעות פעולות גומלין ב α = 0.1 בכדי למזער את הסיכון של טעויות מסוג 2 (Type II errors). פעולות גומלין משמעותיות הוערכו ע"י שימוש בהשוואה ליניארית (linear contrasts) והשפעות עיקריות נבדקו ע"י השינוי הבלתי משמעותי ביותר – least significant difference (LSD) במשמעות פרוצדורת הפרדה (separation procedure). הנתונים ללא שינוי מוצגים.
ילודים שהוזנו עשב אנדופיטי (עיגול) או ללא אנדופיט (משולש) A.ipsilon של (±SEM)תרשים 1 צבירת משקל
תוצאות
A. ipsilon השפעות אנדופיט על התפתחות
זחלי A. ipsilon שניזונו מעשב לא-אנדופיטי צברו מאסה גדולה יותר מהר יותר מאשר זחלים שניזונו מעשב אנדופיטי במהלך הניסוי (תרשים 1 (F=2.95,d.f.=4,42;P=0.03;. לא היה הבדל משמעותי בזמן עד להפיכה לגולם (P> 0.05) או התפתחות בין זחלים שניזונו מדיאטות שונות (נתונים אינם מוצגים). מספר הימים הממוצע עד להפיכה לגולם בעבור זחלים שניזונו מעשב לא-אנדופיטי היה בערך 37 ולאלו שניזונו מעשב אנדופיטי בערך 38 ימים.
השפעות עשב נגוע באנדופיט שגודל בשדה על רגישות A. ipsilon בשלב הביניים הרביעי לנמטודות
באופן כללי, לסוג העשב הייתה השפעה משמעותית על שיעור התמותה של זחלים בשלב הביניים הרביעי (4th insatr) בשל הכנסת S. carpocapsae (f=4.2, d.f.=2, 24 ; p=0.03). הזחלים שניזונו מחלקות המכילות רמות אנדופיט גבוהות הציגו שיעור תמותה ממוצע מצטבר נמוך באופן משמעותי מאשר זחלים שניזונו מחלקות עם אחוז בינוני או נמוך של צמחים נגועים באנדופיט. הייתה אינטראקציה בין רמות האנדופיט בעשב ומשך הזמן עד לתמותה (תרשים 2 ; P=0.06). בשלב מוקדם של הניסוי, זחלים שניזונו מעשב מחלקות עם שיעור אנדופיט גבוה הציגו שיעור תמותה נמוך ב20 ו28 שעות לאחר החשיפה לנמטודות מאשר זחלים שניזונו מעשב מחלקות עם שיעור אנדופיט נמוך (t>2.1, d.f.=2, 24, p=0.05). מצאנו כי כמעט כל הזחלים מתו עד 42 שעות לאחר החשיפה. לא נמצא הבדל במשקלם של הזחלים שניזונו מחלקות עשב עם ריכוז אנדופיט גובה, בינוני או נמוך (p=0.05).
תרשים 2 תמותה ממוצעת (±SEM) של A.ipsilon בשלב הביניים הרביעי בשל s.carpocapsae לאורך זמן. זחלי (A) גודלו על P.ryegrass, צמחים המכילים שיעורים גבוהים, בינוניים ונמוכים של אנדופיטי Neotyphodium lolii. רמות גבוהות, בינוניות ונמוכות של אנדופיט הכילו ביחס ישיר: יותר מ90% צמחים נגועים באנדופיט פטרייתי, בין 40% ל60% נגועים ופחות מ20% נגועים. אפיקי הטיפול היו: חרקים שניזונו מגזירי עשב עם אנדופיט גבוה ונחשפו לנמטודות (משולש שחור), אנדופיט בינוני וחשיפה לנמטודות (ריבוע שחור), אנדופיט נמוך וחשיפה לנמטודות (עיגול שחור), אנדופיט גבוה וללא נמטודות (משולש לבן), אנדופיט בינוני וללא נמטודות (ריבוע לבן), אנדופיט נמוך וללא נמוטודת (עיגול לבן). מינון הנמטודות היה 60 צעירים זיהומיים לכל חרק.
ניסוי מינון
התוצאות שלנו תומכות בהיפותיזה לפיה חרקים בשלב הביניים שני-שלישי מתו מהר יותר מחרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי לאורך זמן (F = 2.6, d.f. =3, 190, P = 0.05; Figure 3b). בנוסף, חרקים בשלב הביניים שני-שלישי סבלו משיעור תמותה ממוצע מצטבר גדול יותר מאשר חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי בכל מינון נמטודות, לא כולל בקרים (תרשים 3 (F = 3.6, d.f. = 3, 64, P = 0.02;. עשרים נמטודות בעבור כל זחל גרמו לשיעור תמותה מצטבר של 87.4% ( ± 8.5%)בעבור חרקים בשלב הביניים שני-שלישי ובשיעור תמותה מצטבר של 74.2% ( ± 5.4%) בעבר חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי. אולם 40 נמטודות בעבור כל חרק גרמו לשיעור תמותה מצטבר דומה (90.9 ± 5.0%) בעבור חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי לזה של 20 נמטודות בעבור חרק אצל חרקים בשלב הביניים שני-שלישי (87.4% ± 8.5%). מינון של 40 נמטודות בעבור כל חרק גרם לשיעור תמותה מצטבר של 99% ( ± 0.0%) אצל חרקים בשלב הביניים שני-שלישי. לבסוף, לקח כ 24-28 שעות לחרקים בשלב הביניים שני-שלישי החשופים ל20 נמטודות להציג שיעור תמותה גדול מ50%, לעומת חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי בהם לקח לנמטודות 32 שעות בכדי לגרום לשיעור תמותה גדול מ50% כאשר נחשפו החרקים ל20 נמטודות בעבור כל חרק. החרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי שנחשפו ל40 נמטודות בעבור כל חרק הציגו בממוצע שיעור תמותה גדול מ50% לאחר 28 שעות. לפיכך אנו בחרנו להשתמש בניסויים עתידיים ב- 20 נמטודות בעבור כל חרק בשלב הביניים שני-שלישי וב40 נמטודות בעבור כל חרק בשלב הביניים רביעי-חמישי.
השפעות עשב שגודל בחממה על רגישות חרקי A. ipsilon בשלב הביניים רביעי-חמישי לנמטודות
בניסיון השני שלנו מצאנו שיש פעולת גומלין בין משך הזמן ונוכחות אנדופיט ((F =27.3, d.f. = 21, 77; P < 0.01. זחלים שניזונו מגזירי עשב לא-אנדופיטים מתו באופן מוקדם משמעותית מאלו שניזונו מגזירי עשב אנדופיטיים ב24 שעות (תרשים 4 (F = 7.2, d.f. = 1, 11;P = 0.02;. זחלים שניזונו מעשב לא-אנדופיטי סבלו משיעור תמותה של כ60%(± 11.8%) לאחר 28 שעות לעומת הזחלים שניזונו מעשב אנדופיטי שסבלו משיעור תמותה של 47.5%(± 7.9%) בלבד. לא היה הבדל משמעותי לאחר 32 שעות. בשונה מהניסיון הראשון, לא היה לנו שינוי כללי בתמותת זחלים בשל אנדופיט. משקל הזחלים לא היה משתנה-נוסף משמעותי בעבור ניסיון זה. זחלים מתים שניזונו מעשב אנדופיטי הכילו כ-4.9 ± 0.6 נמטודות שחדרו לכל זחל לעומת זחלים שניזונו מעשב חופשי מאנדופיט שהכילו 5.0 ± 0.6 נמטודות לכל זחל (p>0.05).
תרשים 3 שיעור תמותה ממוצע מצטבר לאורך זמן(± SEM) של זחלי A.ipsilon בשל s.carpocapsae.
חרקים בשלב הביניים שני-שלישי (עמודות לבנות) ובשלב הביניים רביעי-חמישי (עמודות שחורות) נחשפו ל0, 10, 20 או 40 s.carpocapsae צעירים זיהומיים בעבור כל חרק. עמודות עם אותיות שונות משמעותית ב α = 0.05.
A:תמותת(± SEM) חרקי A.ipsilon בשלב הביניים שני-שלישי (עיגול לבן) ורביעי חמישי (עיגול שחור) בשל s.carpocapsae לאורך זמן (B: זמן X פעילות גומלין חרקים).
השפעת אנדופיט על רגישות חרקי A. ipsilon בשלב הביניים שני-שלישי לנמטודות
מצאנו כי לא היו השפעות משמעותיות (P > 0.05) של זיהום אנדופיט על רגישות זחלים בשלב ביניים מוקדם לנמטודות אנטומופתוגניות לאורך זמן או כממוצע תמותה כללי מצטבר (תרשים 5a). מצאנו כי זחלים שניזונו מעשב נגוע באנדופיט חוו כ 50% שיעור תמותה בתוך 24 עד 28 שעות למן החשיפה לנמטודות, לעומת זחלים שניזונו מעשב חופשי מאנדופיט סבלו מ50% תמותה או יותר בתוך 28 עד 32 שעות למן החשיפה (תרשים 5a). אולם, תצפיות אלו לא היו שונות באופן משמעותי. בניסוי השני, זחלים שניזונו מגזירי עשב חופשי מאנדופיט סבלו מכ78% אחוז תמותה (תרשים 5b). כמו כן לא הראה הניסוי השני שינוי משמעותי ברגישות A. ipsilon ל S. carpocapsae (תרשים 5b ; (P > 0.05. בנוסף, זחלים שניזונו מאו עשב אנדופיטי או לא-אנדופיטי ונחשפו לנמטודות הראו בממוצע שיעור תמותה של 50% סביב השעות 32-36 לאחר החשיפה (תרשים 5b; בהתאמה .(51.1 ± 10.5% and 52.5 ± 11.8%,בנוסף, לא היה קשר הדדי משמעותי בין משקל הזחלים לתמותה ((P > 0.05.
תרשים 4 תמותה ממוצעת (± SEM) בשל S. carpocapsae של A.ipsilon בשלב הביניים רביעי-חמישי שגודלו על צמחים מחממה המכילים או למעלה מ95% זיהום אנדופיט (E+) או ללא זיהום אנדופיט (E-). ריכוז נמטודות בניסוי זה היה כ35 צעירים זיהומיים לחרק מארח. אפיקי טיפול היו כלהלן: ניזונו מ E+ ונחשפו לנמטודות (עיגול שחור), ניזונו מ+E ולא נחשפו לנמטודות (עיגול לבן), ניזונו -E ונחשפו לנמטודות (משולש שחור) וניזונו-E ולא נחשפו לנמטודות (משולש לבן).
ניסוי שדה
התוצאות של ניסוי זה היו דומות לאלו של ניסויי המעבדה שעשו שימוש בחרקים משלב הביניים הרביעי. שיעור תמותה המיוחס בהשערה לנמטודות לאחר 36 שעות בשדה היה נמוך יותר בעבור A. ipsilon שניזון מעשב אנדופיטי (16 ± 8.3%) מעשר בעבור זחלים שניזונו מעשב לא-אנדופיטי (תרשים 6 ; ; P=0.02
.(51 ± 15.1%;F = 14.3, d.f. = 1, 4
תרשים 5 תמותה ממוצעת (± SEM) בשל S. carpocapsae אצל A. ipsilon בשלב הביניים שני-שלישי שניזונו P.ryegrass נגוע באנדופיט (> 75% (A) or > 95% (B) E+)או חופשי מאנדופיט (E–). ריכוז הנמטודות ששימש את שני הניסויים היה 20 צעירים זיהומיים לכל חרק. אפיקי טיפול היו כלהלן: ניזונו מE+ ונחשפו לנמטודות (עיגול שחור), ניזונו מ+E ולא נחשפו לנמטודות (עיגול לבן), ניזונו מ E- ונחשפו לנמטודות (משולש שחור) וניזונו מE- ולא נחשפו לנמטודות (משולש לבן).
תרשים 6 ניסוי שדה. תמותת A.ipsilon בשלב הרביעי שנחשף ל S.carpocapsae במשך 36-38 שעות בחלקות שדה של P.ryegrass "שוער" נגוע-אדנופיט ולא נגוע אנדופיט. זחלים הוגבלו ע"י צילנדרי PVC בקוטר 21 ס"מ. נמטודות ששימשו לניסוי הוכנסו בשיעור 0.5 מיליארד לאקר, כמות שהיא מחצית השיעור המומלץ.
דיון
ה A.ipsilonבשלב הרביעי שניזונו מ p.ryegrassעם שכיחות גבוהה של אנדופיט היו בעלי רגישות נמוכה יותר לS. Carpocapsae מאלו שניזונו מצמחים עם שכיחות נמוכה יותר או ללא נוכחות של אנדופיט למשך לפחות חלק מתקופת החשיפה. ברברצ'ק (Barbercheck) (1993) מצא כי זחלי תולעת שורשי התירס הדרומית (southern corn rootworm larvae, Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) הנחשפת לS. Carpocapsae הציגה שיעורים גבוהים יותר של תמותה כאשר ניזונה מדלעת (cucurbitacins) בהשוואה לכאשר ניזונה מבוטנים. אולם, בחרקים שניזונו מדלעת היו שיעורי העמדת צאצאי נמטודה נמוכים יותר בעבור כל נשא, מה שמצביע לפיכך על האפשרות של אפקט טרפני (terpenoid effect). למעשה, ברבצ'ק ווונג ((Barbercheck & Wang (1996) מצאו כי cucurbitacin D יכול להשפיע לרעה על התפתחות Xenorhabdus ו Photorhabdus spp, שניהם בקטריות סימביוטיות של נמטודות אנטומופתוגניות. בנוסף, אפסקי וקפינרה ((Epsky &Capinera (1994) מצאו כי A. ipsilon שניזונו מכרוב המכיל glucosinolates היוו נשאים גרועים בעבור רביית S. Carpocapsae בגלל הבדלים בתכולת החלב (lipid). עשבים אנדופיטיים יכולים להשפיע לרעה על נמטודות פייתופתוגניות (פתוגניות לצמחים, phytopathogenic) (Elmi et al., 2000). האלקלואידים המופקים בידי p.ryegrass אנדופטי ו tall fescue (זן עשב) יכולים גם כן להקטין את הישרדות ושיעור ההדבקה של הנמטודות האנטומופתוגניות Heterorhabditis bacteriophora Poinar (Grewal et al., unpubl.data). אנטומופתוגנים אחרים יכולים גם כן להיות מושפעים לרעה בידי מטבוליטים שניוניים (Krischik et al.,1988; Costa & Gaugler, 1989). לפיכך, הירידה ברגישות A.ipsilon בשלב הביניים הרביעי לנמטודות עשוייה להיות בשל השפעות רעילות ישירות של אלקלואידים על S. Carpocapsae או על הבקטריה הסימביוטית לנמטודות, X. nematophilus. אך יש גם אפשרות של שינוי פיסיולוגי של A. ipsilon המוליך להגנה מוגברת כנגד הנמטודות. זחלים לבנים (White grubs, (Coleoptera: Scarabaeidae הניזונים משורשים של עשבים אנדופיטים סובלים רק מהשפעות לא-קטלניות הכוללת צבירת משקל מופחתת והתפתחות איטית יותר (Potter et al., 1992; Crutchfield & Potter, 1995). גרוולט al ((Grewalet al (1995) גילה זחלי P. japonica הניזונים מ tall fescueאנדופטי היו רגישים יותר להתקפה מ H. bacteriophora. אך ריכוז האלקלואידים הגדול ביותר מעשבים אנדופטים נמצא לרוב בחלקים אוויריים (aerial) (Carroll,1988). לפיכך, ריכוז האלקלואידים בו נתקלים לרוב חיפושיות (scarabs) יהיה נמוך באופן משמעותי מריכוז האלקלואידים בו פוגשים מזיקים הניזונים מעלווה. הרגישות המוגברת של זחלים לבנים (white grubs) הניזונים משורשים של tall fescue אנדופטי לנמטודות אנטומופתוגניות עשוי להיות בשל הסינרגיזם בין ריכוזים נמוכים של אלקלואידי אנדופיט והנמטודות האנטומופתוגניות. בניגוד לכך, הרגישות המופחתת של A. ipsilon ל S. carpocapsae עשוי להיות קשור ליכולת הזחלים לסבול ריכוזים גבוהים של אלקלואדים בצמחים הנגועים באנדופיט. סיבה נוספת לירידה ברגישות A. ipsilon לנמטודות אנטומפתוגניות יכולה להיות רכישת הגנה חדשה בידי הזחל בזמן ההזנה מעשב אנדופיטי. פרזיטיודים ((Parasitoids יכולים להיות מושפעים בידי אלקלואידים של צמחים הנצרכים בידי הזחל הנשא 1979; Barbosa et al., 1991) (Campbell&Duffey,.. אלקלואידים עשויים להפוך נשאים למרתיעים בפני האויבים הטבעיים שלהם בשל העברת (sequestration) והכללת (inclusion) אלקלואידים לתוך קליפתם החיצונית (cuticles) של חרקים או ההמו-לימפה (hemolymph) שלהם ((Montllor et al., 1991; Schaffner et al., 1994. מחקרים עדכניים הדגימו כי חרקי lepid-opterans בשלבי ביניים מוקדמים הינם רגישים יותר לאנטומופתוגנים מאשר חרקים בשלבי ביניים מאוחרים יותר(Escribano et al., 1999; Huang et al., 1999). כמו כן, הניסויים שלנו הדגימו כי חרקים בשלב הביניים שני-שלישי שנחשפו ל0, 10, ו20 צעירים זיהומיים לכל חרק מתים מהר יותר מחרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי. מסתבר כי גיל הינו גורם חשוב ברגישות A. ipsilon לנמטודות. אולם ככל שמינון הנמטודות גדל קטנו גם ההבדלים בתמותה. אנו מצאנו בכל הניסויים כי חרקים בשלבי ביניים מוקדמים שניזונו מעשב אנדופטי הינם רגישים ל S. carpocapsae באותה מידה כמו אלו הניזונים מעשב לא-אנדופיטי. אולם, גילינו כי חרקים בשלב הביניים רביעי-חמישי שניזונו מ P.ryegrass אנדופיטי היו רגישים פחות לנמטודות מאשר זחלים שניזונו מעשב חופשי מאנדופיט. לפיכך אנו מציעים שזחלי A. ipsilon מתפתחים מקבלים תועלת מאכילת P.ryegrass נגוע באנדופיט. אנו גם אשררנו את תוצאות וויליאמסון ופוטר (Williamson & Potter) (1997a) לפיהן A. ipsilon הניזון מ P.ryegrass אנדופטי מראים ירידה בצבירת משקל אך לא עלייה משמעותית בזמן ההתפתחות. הזחלים שניזונו מעשב אנדופיטי היו בעלי מאסה גדולה יותר לאחר ש35 יום בניסויים שלנו מכיוון שחלק מהזחלים שניזונו מעשב לא אנדופיטי ניכנסו לשלב טרום-גולם ללא תזונה, ולפיכך שקלו פחות. אנו מציגים ראיות לכך ש A. ipsilon מסוגל להיזון ולהתפתח מ P.ryegrassאנדופיטי למרות שזחלי פרפר (lepidoperans) אחרים מושפעים לרעה מכך (Richmond & Shetlar, 1999). אנו מסכמים ש A. ipsilonמסוגל להשלים את התפתחותו כאשר הוא ניזון בלעדית מ מ P.ryegrassאנדופיטי, אך זה מוביל לצבירת משקל מופחתת. זה מצביע על כך ש P.ryegrassאנדופיטי אינו הצמח הנשא הטוב ביותר להתפתחות הזחלים, בייחוד מאחר שיש זמן רב עד להפיכה לגולם. אך גרוולט al (Grewalet al) (1995) מציע כי העדר מזון נאות עשוי להגביר למעשה את רגישות זחלים לבנים (white grubs) לנמטודות. לפיכך אמור A. ipsilon להיות קל יותר לשליטה בעזרת S. carpocapsae בגלל הצמח הנשא הדל, אך נראה כי המציאות אינה כך. חרקים בשלבי ביניים מוקדמים הינם רגישים יותר ל S . carpocapsaeוככל שהזחל מתבגר הם הופכים עמידים יותר לזיהום נמטודות. בבדיקות מעבדה הואכלו באופן בלעדי גזירי עלה-מוארך (leaf blade) אך בשדה כל הצמח יכול להאכל. מאחר וריכוז הפטרייה הגדול ביותר הוא בנרתיק העלה והכתר, ייתכן והזחל בבדיקות מעבדה לא נתקל באותם ריכוזים של קור (hyphae) פטרייתי כבמצבי שדה. בנוסף, ייתכן והגבלת הזחלים לזירות ניסוי בהן מובטח מגע בלבלה את תוצאותינו. וויליאמסון ופוטר (1997b) מצאו כי זחלי A. ipsilon יכולים לנוע מרחקים נכבדים בלילה. לפיכך תוצאות בשדה ללא הגבלת הזחלים עשויים להראות הבדלים דרסטיים יותר בין זחלי A. ipsilon הניזונו מעשבים אנדופיטים מול לא אנדופיטים. למרות שההשפעות נראות כחולפות בבדיקות מעבדה, מצבי שדה עשויים להיות עלייה באורך החיים שאולי מאפשר לזחל לגרום נזק כלכלי באזורים בעלי ערך גבוה בהן סף הנזק נמוך באופן קיצוני. מחקר עתידי צריך להיות מכוון למציאת המכניזמים של ירידת הרגישות של A. ipsilon לנמטודה האנטומופתוגניות S . carpocapsae.
[1] לא הצלחתי למצוא את השם העברי, בתרגום חופשי זה "עשב-שיפון רב שנתי" ולהלן: p.ryegrass
[2] Instar – גם כאן לא הצלחתי למצוא מילה בעברית, מדובר בשלב ביניים בחיי החרק בין השרות, למשל השלב בין הבקיעה וההשרה הראשונה. Instar להלן: "חרק בשלב ביניים" –רביעי-חמישי= בין ההשרה הרביעית לחמישית.
