תרגום מאמר – קשירת רעלנים

רעלני Cry1A של Bacillus thuringiensis קשורים ספציפית לאזור סמוך לאתר BT-R1 חוץ-תאי צמוד-ממברנה ב Manduca sexta: התפתחות cadherin באנטומופתוגניות של Bacillus thuringiensis

ג'י.אי. דורש (J.A.Dorsch), ושות'

מילות מפתח: Bacillus thuringiensis, BT-R1, אנטומופתוגניות (Entomopathogenicity), רעלני CRY, תאים טרנספקטים ((Transfected cells, COS-7, cadherin, חלבון טרנסממברנלי (Transmembrane protein), קוטל-חרקים ((Insecticide, Integrin.

תקציר

תתי-מינים רבים של בקטריית האדמה Bacillus thuringiensis מפיקים חלבונים פרספורליים גבישיים (parasporal crystal proteins) מגוונים הידועים גם כקריטוקסינים ((Crytoxins המציגים פעילות מדבירת-חרקים כאשר הם נקשרים לרצפטור ספציפי במעי האמצעי (midgut) של חרקים רגישים.

אחד מרצפטורים אלו,  BT-R1(210kDa), הוא קדהרין (cadherin) הממוקם באפיתל המעי האמצעי של תולעת קרן-הטבק (tobacco hornworm), Manduca sexta. יש לו אפיניות קשירה גבוהה               ( 1nM~Kd ) לרעלני Cry1A של B. thuringiensis. ניתוח ניתוח קיטוע (Truncation analysis) של BT-R1 חשף שהחלק היחיד המסוגל לקשור את רעלני Cry1A של B. thuringiensis היה רצף של 169 חומצת אמינו הסמוך לאתר החוץ-תאי צמוד הממברנה                                          (membrane-proximal extracellular domain). המקטע קושר-הרעלן המזוקק התנהג כנוגד (antagonist) לרעלן  Cry1Abע"י חסימת קשירת הרעלן למעי האמצעי של תולעת הטבק ודיכוי פעולות משמידות חרקים. רעלן Cry1Ab אקסוגני (ממקור חיצוני) נקשר לתאי cos-7 שלמים המבטאים  BT-R1 CDNA, ולאחר מכן הורג את התא. גיוס BT-R1 בידי B. thuringiensis מצביע על כך שהבקטריה מקיימת אינטראקציה עם מולקולת הקשירה (cell adhesion molecule) בזמן היווצרות המחלה. ככל הנראה, רעלני CRY, כמו רעלני בקטריה אחרים, תוקפים מחסומים אפיתלים ע"י התכוננות למולקולות קשירה של התא בתוך חרקים מארחים רגישים. 2002Elsevier© Science Ltd  כל הזכויות שמורות.

1.הקדמה

מאז התגלה ש  BT-R1, cadherin הממוקם באפיתל המעי האמצעי של תולעת קרן-הטבק, Manduca sexta , משמש כרצפטור לרעלני  Cry1A של Bacillus thuringiensis (Vadlamudi et al., 1993, 1995), היה עניין גובר באופייה של המולקולה והאינטראקציה שלה עם הרעלנים. Cadherins זוהו בחסרי-חוליות אחרים כרצפטורי מטרה קריטיים בעבור רעלני CRY                                         (Gahan et al., 2001; Griffitts et al., 2001; Nagamatsu et al., 1998, 1999). חלבונים אלו מייצגים משפחה גדולה של גליקופרוטאינים טרנס-ממברנליים תלויי-סידן האחראים על שמירת שלמות קשרי התא-תא באורגניזמים רב-תאיים. ברקמות האפיתל cadherins  תורמים לביסוס מחסום מגן. הם גם מעורבים באירועי הקשרות (adhesion) של תא לתא בזמן התרבות, הבחנה (differentiation) וחבירה ע"י קיום יחסי גומלין עם חיבורי חלבון תאיים אחרים ועם נתיבי טרנסדוקציית אותות (signal transduction pathways) דרך הectodomain (EC) שלהם ואתרים ציטופלסמים (cytoplasmic domain, CYTO) בהתאמה. (Ruoslahti and Obrink, 1996; Nollet et al., 2000; Angst et al., 2001; Takeichi, 1991).

ככל הנראה, cadherins מתווכים בפעילות רעלני CRY במעי האמצעי של חרקים ע"י קשירת רעלני CRY באפיניות גבוהה מה שגורם להרס שלמות המבנה והפעילות של האפיתל במעי האמצעי ובסופו של דבר למוות. Cadherins מיושמים גם בעמידות חרקים לפעילות קוטלת-החרקים של רעלני CRY (Gahan et al., 2001). עמידות תולעת ניצן-הטבק Heliothis virescens, תולעת חשובה לחלקאות, לרעלני Cry1A קשורה להפרעה retrotransposon-mediated של  גן cadherin ספציפי, מה שמעיד על כך שcadherins באפיתל המעי האמצעי מעורבים ישירות באנטומופתוגניות של B. thuringiensis (Gahan et al., 2001). ביטויו של רצפטור הcadherin BT-R1 הוא ספציפי לתאי האפיתל של המעי האמצעי בשלב הזחל של M. sexta (Midboe et al., 2001). העובדה שהמולקולה אינה קיימת בשום שלב אחר של מחזור החיים של החרק מעיד על כך שקשירת רעלני CRY למולקולת הפנים של תא הזה היא בעלת חשיבות התפתחותית לפתוגניות של  B. thuringiensis. רצפטורי BT-R1, הן המשובטים  (Vadlamudi et al., 1993; Francis and Bulla, 1997) והן הטבעיים (Vadlamudi et al., 1993; Francis and Bulla, 1997) הינם בעלי אפיניות גבוהה (Kd~ 1nM) וספציפיות לרעלני  Cry1A של B. thuringiensis. רעלני Cry1A נקשרים ל BT-R1ללא קשר לצורות הרקומביננט (recombinant) השונות בהן מציגים תאים את הרצפטור (Keeton and Bulla, 1997; Meng et al., 2001).

במחקר הנוכחי ניתוח רצף חומצת האמינו וחיזוי מבנה הcadherin BT-R1 חשף כי למולקולה יש EC המורכב מ12 מודולים (modules) של EC ושהיא מכילה את רצפי-הזיהוי (recognition sequences) HAV (Blaschuk et al., 1990) וכן את RGD (Pierschbacher and Ruoslahti, 1984) וLDV (Wayner et al., 1989) המאפשרים אינטראקציית חלבונים עם מולקולות cadherin אחרות וintegrin, בהתאמה. פפטידים קטועים ששובטו מ BT-R1 עובדו ב "rabbit reticulocyte lysates" (RRL) ויכולתם להקשר עם רעלני Cry1A נקבעה. המקטע הקצר ביותר שהספיק בכדי לקשור את הרעלנים היה קטע של 169 חומצת אמינו לא-סוכרית (nonglycosylated) על הEC, צויין בתור "אזור קושר רעלנים" – TBR – toxic binding region. תוצאות ניסויי קיטוע (truncation) נוספים מיקמו את פפטיד הTBR על EC11 וחשפו כי קשירת רעלנים הינה מוגבלת למקטע של 67 חומצות אמיניו בתוך פפטיד הTBR. EC11 ממוקם האתר החוץ-תאי צמוד הממברנה (membrane-proximal extracellular domain ) של .BT-R1 הTBRים (ברבים) של רצפטור הcadherin, BtR175 מ- Bombyx mori (Nagamatsu et al., 1999) וBT-R1 חופפים זה עם זה בEC שלהם ויש להם זהות ב80% מרצפי חומצות האמינו.

קשירת רעלני Cry1A באופן ספציפי לאזור הסמוך לאתר החוץ-תאי צמוד-הממברנה (MPED) של BT-R1 עשוייה להיות קריטית באופן מכני לאינטראקציית של רעלני CRY עם פני התאים באפיתל המעי-האמצעי. באופן משמעותי, רעלני Cry1Ab המריצו ציטו-טוקסיות (cytotoxicity) בתאי COS-7 וHEK 293 המציגים את BT-R1 על פני השטח שלהם, מה שביסס לראשונה כי BT-R1 מתווך את מות התא עם הקשרות לרעלני CRY. בנוסף, האכלת זחלי M. sexta רעלני Cry1Ab מעורבים עם פפטיד הTBR הובילה לעצירה מוחלטת בפעילות קטילת-החרקים, מה שמדגים כי קשירת הרעלן ל BT-R1 בחרק היא הכרחית לפעילות קטילת-החרקים. זיהוי הTBR  ברצפטור BT-R1הוא שלב חשוב בהבנת פעולת הרעלן   Cry1Aומעורבות cadherins באנטומופתוגניות של . B. thuringiensis

2.שיטות וחומרים

2.1 בניית מקטעי BT-R1 שבור, שיבוט וביטוי.

הcDNA  המקדד את 1717 חומצות האמינו של חלבון  BT-R1שובט (Vadlamudi et al., 1995) אל תוך וקטור הפלסמיד ( plasmid vector) pBluescript (stratagene- גן-רובד). קטעים שבורים של הcDNA של BT-R1 הושגו על ידי שימוש באתרי התבקעות (cleavage sites) מגבילי   endonuclease (אנזים השובר קשרי זרחן בDNA) ספציפים המוצגים על ה cDNA  ותת-שובטו (subcloned) ע"י שיטות שיבוט סטנדרטיות אל תוך וקטור הפלסמיד pCITE (Novagen) בעבור מערכת התעתיק-תרגום האל-תאית (cell-free transcription–translation system). נעשה שימוש באנזימי ההגבלה ((restriction enzymes הבאים: Bam HI, Eco RV, Hinc II, Sac I , ו- Sty I.

כל DNA  הפלסמיד טוהרו ע"י סרכוז (הפרדה בצנטריפוגה) כלור-צסיום ((cesium chloride הדרגתי וסודרו (sequenced) בשימוש בשיטת סגנר (Sanger) בהתאם להוראות היצרן (United States Biochemical Corp.) שברי הDNA תת-שובטו (subcloned) אל תוך וקטור הפלסמיד pET-30b (Novagen) לשם תיוג פולי-היסטידין וביטוי בתאי .E. coli BL21(DE3)

בקיצור, ביטוי וטיהור הפפטידים היה כלהלן. מושבות בקטריה נבחרו וגודלו במהלך לילה ב  5 מ"ל LB     medium בטמפרטורת חדר. ל-100 מ"ל של LB medium הוכנסו 2 מ"ל של תרבית הלילה וגודלו ל –  OD600nm =  0.65. ביטוי חלבון בתרבית הושרה ע"י הוספת תמיסת 1 M ( µl100) של  isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG). התמיסה המוספת הודגרה בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות ותאי E.coli נעשו הומגנים (homogenized) ע"י sonication. חלבונים מובעי-תמיסה (Soluble expressed proteins) נותחו על 8% SDS–PAGE ולאחר מכן הכתמת (blotting) הג'ל לממברנות פוליוינל דיפלואוריד ((polyvinyl difluoride (PVDF) (Millipore). חלבונים מתוייגי-היס (His-tagged) טוהרו על עמודת אפיניות ניקל (nickel affinity column), מולאו והופעלו כמתואר ע"י נובגן (Novagen). חלבון מטוהר רוכז והותפל (desalted) בעמודות סיבוב Centricon10 (Centricon10 spin columns) (Centricon) ונבחנו ב bicinchoninic acid method (Pierce Chemical Co.) עם סרום אלבומין שורי (של שור) (bovine serum albu­min) (BSA, fraction V) כסטנדרט.

2.2 טיהור ו [1]radioiodination רעלנים

תמיסת פרוטוקסינים Cry1Aa, Cry1Ab ו- Cry1Acרקומביננטים הוכנה מתאי E.coli ששונו עם פלסמידים הנושאים את גן הCRY המתאים. הפרו-טוקסינים הופעלו עם אנזים טריפסין (trypsin) Hofmann et al, 1998)) והרעלנים שנוצרו טוהרו ע"י שימוש בעמודת חלופת-אניון Mono-Q (Mono-Q anion-exchange column) במערכת FLPC  במעברת ביו-טק AP. לרעלנים הוחדר יוד (iondination) כמתואר (Keeton and Bulla, 1997) בשימוש ב- chloramine-T. פעילויות ספציפיות (10–15 mCi/mg) של כל שלושת הרעלנים נקבעו ע"י הפרדה עם  חומצה אצטית טרי-כלורידית (trichloroacetic acid) של האלואטים (חומרי מיצוי – eluates) מעמודת ההתפלה ולאחר מכן ספירת ניצוצות (scintillation counting).

2.3 נוגדנים רב-משובטים (polyclonal) כנגד BT-R1 וTBR

BT-R1 בודדו משלפוחית חיכוך גבול ממברנה (brush border mem­brane vesicles – (BBMV של M. sexta וטוהרו כמתואר לעיל (Vadlamudi et al., 1993). עשרה  µg של החלבון עורבבו עם סייע פרוינד מלא (Freund s complete adjuvant) והוזרקו תת-עורית לארנב ניו-זילנדי לבן (New Zealand white rabbit). זריקות דחף של עשרה µg בסייע פרוינד חלקי ניתנו בשלוש ושש שבועות. שבועיים לאחר זריקת הדחף האחרונה נלקח דם מהארנבים וסרום נאסף ע"י הקרשה ולאחריה צנטריפוגה במהירות נמוכה. פפטיד רקומביננטי של TBR טוהר כמתואר לעיל ואנטי-סרום ארנבי כנגד הפפטיד הושג מAlphaDiagnostic International (סן-אנטוניו).

2.4 הכנת BBMV

BBMV הוכנו מהמעי האמצעי של חרקים בהתאם לפרוצדורה שתוארה בידי וולפרספברגר ושות' (Wolfersberger et al) (1987) ושופרה בידי קיטון ושות' (Keeton et al) (1998).

2.5 הכתמת (blotting) Radioligand

אלקטרופוריזת ג'ל (Gel electrophoresis) בוצעה לפי הפרוצדורה של לאמלי (Laemmli) (1970). בחינות קשירה בוצעו כמתואר (Hofmann et al.,1988a, b). בקצרה, חלבונים מג'לי SDS הוכתמו לממברנות PVDF (Millipore) בעזרת מתקן הכתמה יבש למחצה ((semidry blotting apparatus (Owl Scientific). הממברנות המוכתמות נחסמו למשך שעתיים בטמפרטורת חדר עם תמיסת Tris HCl ממותנת (בופר) (TBS ; pH8.0) המכילה 5% אבקת חלב יבשה ללא שומן, 5% גליצרול,               0.5% Twenn 20 ו0.025% אזיד נתרן. הממברנות אז הודגרו עם רעלן ¹²⁵I-Cry1A ~1 nM)) למשך שעתיים בטמפרטורת חדר, נשטפו שלוש פעמים (30 דקות כ"א), עם בופר חוסם ונחשפו במשך לילה לסרט קודאק X-Omat AR אוטורדיוגפי ב80 מעלות. חיבורי החלבונים נותחו ברזולוציה גבוהה בעזרת Bio-Rad GS525 – מערכת הדמייה מולקולרית.  כמות ה ¹²⁵I- בחלבונים כומתה עם תוכנת Molecular Analyst. בניסויי בלימת תחרות (competition inhibition) ריכוז רעלני CRY מתוייגים היה בערך   nM1 וריכוזים שונים של רעלני CRY בלתי מתוייגים מתחרים הוספו לפני השימוש לבופר החוסם המכיל רעלנים מתוגיים.

2.6 טיפול ברעלנים וביואסאי שרידות (survival bioassays) חרקים

בחינות רעילות שהשתמשו ברעלן Cry1Ab על זחלים ילודים של M.sexta בוצעו כמתואר      (Wabiko et al.,1985). ביצי  Manduca sextaותזונה מלאכותית נרכשו מ- Carolina Biologicals. ביצים הוספו ישירות למגש (24X36 ס"מ) של תזונת תולעת-קרן והודגרו ב 27 מעלות עד שבקעו הביצים (3~ ימים). עם בקיעתם, זחלים ילודים יחידים הועברו למכלי בחינה-ביולוגית (bioassay containers)  (6×6×10 ס"מ) המלאים עד 5mm עם תזונת חרקים מעוקרת מראש. רעלן Cry1Ab (מופעלי- טריפסין) במים (0.125 nM) עורבבו עם ריכוזים עולים של פפטיד TBR ע"י בחישה עדינה בטמפרטורת חדר. ריכוז הרעלן היה שווה למינון ng/cm² 7.5, ערך ה   LC₅₀שבוסס בעבור פרו-טוקסיני  Cry1Ab כנגד זחלים ילודים של M.sexta (Schesser et al.,1977;Schesser and Bulla,1978). לרעלן ופפטיד הTBR ניתנו שעתיים בכדי להגיב, לאחר מכן פוזרו התמיסות באופן שווה על משטח התזונה במכלי הבחינה-הביולוגית וניתן להם להתייבש. זחלים ילודים בודדים הונחו על משטח התזונה המטופל של 10 מכלים נפרדים ובהם ריכוז זהה של רעלן Cry1Ab ופפטיד הTBR. המכלים הודגרו ב27 מעלות ומספרי החרקים החיים והמתים נספרו לאחר 72 שעות. טיפולי בקרה כללו מים ופפטיד TBR בלבד. כל ביו-אסאי נעשה כפול שלוש. נתוני הביו-אסאי נותחו מודל רגרסיה לוגיסטי (logistical regression model) הכלול בחבילת התוכנה MiniTab  (  MiniTabבע"מ).

2.7 מיקרוסקופיית אור

זחלי M.sexta בשלב הביניים השלישי הואכלו רעלן Cry1Ab ( ng/cm²30) במשך שעה עד שעתיים. מעי גס מדוגמאות חיות נותח ב 4 מעלות. הרקמות נשטפו מיד עם 2% פורמלדהיד ו 0.2% glutaraldehyde ב –   M KPO₄0.1 (pH 7.2) ב4 מעלות למשך 15 דקות. המעי האמצעי בותרו בנוסף לחלקים של 2 מ"מ והודגרו למשך שעה נוספת באותה תמיסת קיבוע (fixing). הרקמות נשטפו שלוש פעמים כל אחת  במשך 15 דקות בבופר פוספט ב4 מעלות. ייבוש באלכוהול ולאחר מכן הטבעה בשרף Araldite 502. חלקים דקים נחתכו ע"י סכין זכוכית והוצמדו לזכוכית נושא, הוכתמו עם תמיסת Na₂CO₃ המכילה 0.2% Azure B (pH 8.5) ונבחנו בעזרת מיקרוסקופ אור Leitz.

2.8 ביטוי אקראי של BT-R1 בתאי COS-7

הcDNA ל BT-R1שובט לתוך וקטור ההבעה היונקי (ממשפחת היונקים) (mammalian expression vector )  pcDNA3.1 (Invitrogen) בעזרת אתרי ההגבלה restriction sites) )  Eco RI ו- .Not Iטרנספורמציה וביטוי בתאי COS-7 SV40 של קוף אפריקאי (ATCC CRL-1651) בוצעו כמתואר מקודם (Keeton and Bulla,1997) עם מספר שיפורים. תאי  COS-7 (4×10⁴/well) גודלו על כיסויים (cover slips) של 12 מ"מ שהונחו בצלחת 24-well שהכילה Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) עם10% תוספת סרום שור עוברי מושבת-בחום (FBS). טרנספקציות (Transfections ) עם תבנית הפלסמיד בוצעו בשימוש ב- LipofectAMIN PLUS Reagent^TM (Gibco BRL). התאים הודגרו במשך יומיים ב37 מעלות בDMEM המכיל 10% FBS         באטמוספרה עם לחות של 5% פחמן דו-חמצני. הביטוי של BT-R1  ע"י SDS–PAGE והכתמה-אימיונית (immunoblotting) עם נסיוב נגד (antisera) נוגד BT-R1 או נוגד Cry1Ab. ביטוי פנים על תאי COS-7 מהונדסים זוהו עם מיקרוסקופיה אימיונו-פלורצנטית (immunofluorescence) עם נוגנדי אנטי- BT-R1. בכדי ללמוד את השפעת רעלני CRY על תאים מועברים (transfected cells) התאים הודגרו עם או בלי נוכחות רעלן Cry1Ab במשך 2-4 שעות. התאים נוטרו עם מיקרוסקופיה אימיונו-פלורצנטית עם שימוש בנוגדני אנטי- BT-R1 ונוגדנים משניים שתוייגו עם TRITC (Molecular (Probes.

2.9 מיקרוסקופיה אימיונו-פלורצנטית (immunofluorescence)

תאי ה COS-7 גודלו על זכוכית כיסוי של 12 מ"מ בצלחת 24-well. התאים קובעו והוכנו (permeabolized ) במתנול קר (20- מעלות) או paraformaldhyde 4% למשך 15 דקות ב27 מעלות. זכוכיות כיסוי נשטפו שלוש פעמים עם PBS ונחסמו למשך 15 דקות עם 1% BSA בPBS      . הדגרה עם נוגדן עיקרי בוצעה ב27 מעלות למשך 30 דקות ולאחריה שטיפה וחסימה עם BSA. הנוגדנים זוהו עם TRITC  IgG עיזי (של עז) נוגד-ארנב. זכוכיות כיסוי הוכנו לשימוש עם Fluromount G ונצפו עם מיקרוסקופ Olympus מצוייד עם עדשת Apochromat X40 בשימוש בתאורה אפי-פלרוצנטית (epi-fluorescence illumination). צילום נעשה עם מצלמת SPOT של Olympus.

3. תוצאות

3.1  רצף חומצות אמינו ומבנה משוער של BT-R1

רצף חומצות האמינו המפורש של BT-R1 שהוסק מרצף הנוקלאוטידים (GenBankAF319973) מוצג בתרשים 1. המבנה המוצע של האתר (domain) של BT-R1 תואר בקווים כללים על בסיס הרכב חלבונים, מבנה גנומי וניתוח פילוגנטי (phylogenetic) של cadherins כמתואר ע"י נולט ושות' (Nollet et al) (2000). מולקולת ה BT-R1המלאה מורכבת מ1717 חומצות אמינו. האזור החוץ-תאי מורכב מאתר טרנסממברנלי (TM) יחיד מקובל (Putative) (מודגש) המכיל 25 משקעי חומצות-אמינו וEC המורכב מ12 חזרות cadherin (מודולי EC מוצגים ע"י חיצים). ישנם 14 רצפים קושרי-סידן מקובלים (putative) (אותיות כחולות) המפוזרים לכל אורך הEC. רצפי הכרת Integrin – RGD (Pierschbacher and Ruoslahti,1984) וLDV (Wayner et al. ,1989 ;Mould et al. ,1990 ;Komoriya et al.,1991) נמצאים בEC2 וEC8 (אותיות כתומות), בהתאמה. שתי רצפי קשירת cadherin – HAV (Blaschuk et al.,1990) מקדימים את EC5 וEC11 (אותיות אדומות). האזור הציטוסטולי מכיל 160 חומצות אמינו ואינו מראה רצף הכרה ברור לאינטראקציות ציטו-פלסמיות כפי שקורה בחברים אחרים בסופר-משפחת הcadherin. חומצות האמינו המעורבות באינטראקציה עם רעלני Cry1A מצויינים בסגול ומודגשים.

3.2 מיקום ה- TBR של Cry1Ab

בכדי להבין טוב יותר את אינטראקציות רעלן-רצפטור של Cry1A נבחנה יכולתם של מגוון פפטידי שבירה (truncation peptides) BT-R1 לקשור רעלן. שברי cDNA קטוע של BT-R1 נוצרה ובוטאה בשימוש בוקטור פלסמיד pCITE (Novagen) במערכת תעתיק-תרגום RRL (RRL-TNT) כפפטידי איחוי (fusion peptides). פעילות הקשירה של רעלן Cry1Ab לשברים מוצגת בתרשים 2. הפולי-פפטיד המכיל את חומצות האמינו 1-1528 של אקטו-דומיין ((ectodomain BT-R1 (תרשימים 1 ו2A, פפטיד 1) מתאים לפולי-פפטיד   kDa-175 ונקשר לרעלן Cry1Ab (תרשים 2B, נתיב 1). ע"י ניתוח מגוון פפטידי-איחוי קטועים שנגזרו מהEC השגנו מקטע פפטידM_R = 25kDa) ) המתאים לחומצות אמינו 1296- 1465 של BT-R1 (תרשימים 1 ו2A, פפטיד 7) מצויין בתור הTBR (תרשים 2B, נתיב 7). מקטעים שבורים (תרשים 2A, פפטידים 3 ו-6) החסרים קטע של 67 חומצות אמינו של פפטיד הTBR לא נקשרו לרעלן ה Cry1Ab (תרשים 2B, נתיבים 3 ו-6, בהתאמה), דבר המצביע על כך שפפטיד הTBR הנמצא, בחלקו, על EC11 (תרשים 2A) מכיל אתר קשירה בעל אפיניות גבוהה יחיד של BT-R1 לזיהוי רעלן Cry1Ab. בגלל שמערכת הRRL-TNT יוצרת תוצרים חופשיים ממודיפיקציות פוסט-תרגומיות ((post-translational modifications כגון גלוקוליזציה (glycosylation), מודיפקציות נלוות ((side chain modifications אינן נראות כהכרחיות בעבור קשירה עם הרעלן. הדגרה של  BBMVתולעת קרן-הטבק עם אגלוטינין בוטן המסיר שיירים גלוקוזיים מחלבונים גם כן אינו משפיע על הקשירה (נתונים אינם מוצגים). לפיכך, קשירת רעלני         Cry1Ab ל BT-R1 מתרחשת דרך אינטראקצית חלבון-חלבון ואינה דורשת גלוקוליזציה.

3.3 ביטוי, טיהור וספציפיות של הTBR של BT-R1

שברי הDNA המקדדים את פפטיד הTBR תת-שובטו (subcloned) אל תוך וקטור הפלסמיד  pET  (Novagen) בעבור תיוג וביטוי פולי-היסטידין ב E.coli. פפטיד הTBR הרקומביננטי טוהר בעזרת כרומטוגרפיית עמודת אפיניות-ניקל (nickel affinity column chromatography). רעלני Cry1Aa, Cry1Ab, ו- Cry1Ac מתוייגי-רדיו (Radiolabeled) של B.thuringiensis נקשרו לפפטיד הרקומביננטי (תרשים 2C, נתיבים 2,1 ו3, בהתאמה), מה שמצביע על כך שה TBR (חומצות אמינו 1296-1465, תרשים 2A, פפטיד 7) של רצפטור ה BT-R1 מספקות ספציפיות לכל שלושת רעלני Cry1A.

תרשים 1. רצף חומצות האמינו המפורש של BT-R1. הcDNA ל BT-R1 נאסף מדוגמאות RNA שנלקחו מאפיתל המעי האמצעי של זחלי M.sexta. הcDNA  שובט ורוצף (sequenced) (AF319973) ותוצר החלבון שלו פורש מרצף הנוקלאוטידים. ניתוח רצף חלבונים נעשה עם שרתProfileScan  ISREC (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN). רצף חומצות האמינו המייצג את מודול הEC מודגש (bold) והתחלת כל חזרת cadherin מצויין ע"י חץ. חומצות האמינו המרכיבות את TM המוסכם מובלטות (underscored) ; אתרים קושרי-סידן מוסכמים מסומנים בכחול ; רצפי הכרת integrin ו- cadherin מסומנים בכתום ואדום, בהתאמה. חומצות האמינו המעורבות באינטראקציה עם רעלני Cry1A מסומנות בסגול ומובלטות.

3.4 אפיניות קשירה של הTBR של BT-R1

בכדי לקבוע את אפיניות הקשירה של רעלן CRY ל  TBRבוצע ניתוח קשירת ligand מעכב-תחרות (competition inhibition ligand binding analyses). רעלן Cry1Ab מיודד (עם יוד, Iodinated) הודגר עם רצועות הכתמה המכילות את פפטיד הTBR בנוכחות ריכוזים עולים של רעלן Cry1Ab בלתי-מתוייג (תרשים 3(. רעלני Cry1Ac  ו-Cry1Aa הראו אפיניות קשירה דומה לTBR (נתונים אינם מוצגים). ניתוח קשר סקצ'רד (Scatchard plot) (Scatchard,1949) חשף אתר קשירה יחיד לכל שלושת הרעלנים (= 39nM  .( K_dקודם לכן, ערך K_d של nM 1 בוסס בבחינת תחרות-קשירה שהשתמשה בהכנות BBMV של המעי האמצעי של M.sexta (Vadlamudi et al.,1993). ניסויים עם תאי 193HEK שלמים המבטאים cDNA  של BT-R1 ביססו גם כן ערכי K_d של nM 1.0 לקשירת רעלן Cry1Ab (נתונים אינם מוצגים). למרות שההבדל בערכי ה- K_dהמחושבים בין חלבון  ה BT- R1 באורך המלא לפפטיד הTBR הוא ככל הנראה בשל ההבדל בדוגמאות ובשיטות הניסויי, איננו יכולים לשלול את האפשרות ש BT-R1באורך מלא עשוי להיות בעל מבנה ספציפי כאשר הוא מחובר לממברנה אשר מגדיל אפיניות קשירת רעלן. עם זאת, ערכי ה- K_d בעבור גם BT-R1 וגם TBR הינם ללא ספק בתוך הטווח המקובל של רצפטורים בעלי אפיניות גבוהה.

תרשים 2. קשירת רעלן Cry1Ab לפפטידי BT-R1 קטועים. A: מספרי משקע חומצת האמינו המציינים את ה BT-R1 באורך מלא ווריאציות קטועות ויכולתם לקשרו לרעלן Cry1Ab מתוייג בI¹²⁵ מאויירים בצורה סכמטית. מקטעי cDNA    של BT-R1 קטועים יוצרו ע"י שימוש באתרי ההגבלה כמצויין בקטע 2 (section 2).  מקטעים קטועים תת-שובטו ובוטאו עם His-tag 6X במערכת .RRL-TNT מקטע של 169 חומצות אמינו (פפטיד 7) המכיל את משקעי חומצות האמינו 1296-1465, מכיל קטע של 67 חומצות אמינו המתאים ל EC11 של האקטודומיין (ectodomain) של BT-R1 (תרשים 8). B: קשירת רעלן Cry1Ab לפפטידים קטועים רקומביננטים של BT-R1. נתיב (lane) 1, EC (פפטיד 1) ; נתיב 2, פפטיד 2 ; נתיב 3, פפטיד 3 ; נתיב 4, פפטיד 4 ; נתיב 5, פפטיד 5 ; נתיב 6, פפטיד 6 ; נתיב 7, פפטיד 7 (TBR). C: קשירת רעלני  Cry1Aa(נתיב 1), Cry1Ab (נתיב 2) ו Cry1Ac(נתיב 3) לפפטיד TBR 25- kDa רקומביננטי.

3.5 בלימת הקשרות רעלן Cry1Ab לBBMV עם אנטי-סרום כנגד BT-R1

הספציפיות של BT-R1 כרצפטור לרעלני Cry1A נקבע בוודאות ע"י שימוש באנטי-סרום כנגד פפטיד BT-R1 וTBR כמתחרים לקשירת  Cry1AbלBBMV  של M.sexta. אנטי-סרום נוגד- BT-R1בלם את קשירת רעלן Cry1Ab-¹²⁵I לBBMV באורך תלוי-מינון בעוד שלסרום טרום-אימיוני (pre-immune) מאותו ארנב לא הייתה כל השפעה (תרשים 4). תוצאות דומות נצפו בשימוש באנטי-סרום נוגד-TBR (נתונים אינם מוצגים). תוצאות אלו מעידות על כך שהנוגדנים הרב-משובטים (polyclonal) כנגד BT-R1 וכנגד TBR הינם ספציפיים בעבור הרצפטור הקיים בBBMV של M.sexta ולאתר הקשירה של  BT-R1, בהתאמה. אינטראקציות של נוגדנים אלו עם הרצפטור ועם פפטיד הTBR מונעים הקשרות רעלן לBBMV. תוצאות אלו מאשרות כי BT-R1 מכיל אתר קשירה ספציפי לרעלן Cry1Ab באפיתל המעי האמצעי של תולעת קרן-הטבק ושאתר הקשירה כלול בתוך TBR.

3.6 התנגדות לפעילות קוטלת-החרקים של רעלן Cry1Ab ע"י הTBR של BT-R1

ביו-אסאי (bioassay) חרקים בוצע עם ניצול פפטיד הTBR כמתנגד (antagonist) לרעלן ה-Cry1Ab בכדי להדגים, ברמה המקורית, כי קשירת רעלן ופעילות קטילת-חרקים קשורות הדדית באופן ישיר. רעלן ה- Cry1Ab בריכוז של nM 0.125 (מינון LC₅₀) עורבב עם ריכוזים משתנים של פפטיד TBR. לתערובות ניתן להגיע לשיווי משקל (equilibrium) וניתנו למאכל זחלי תולעת קרן-הטבק שנוטרו במשך 72 שעות. שרידות חרקים היית 85% בריכוז TBR של 150 nM (פי 1200 עודף לרעלן) ועלה ל100% ב 750 nM(פי 6000 עודף). תוצאות הביו-אסאי מראות שקשירת הרעלן CRY ל BT-R1 במעי האמצעי של החרק היא הכרחית בשביל רעילות. בנוכחות פפטיד הTBR, רעלני Cry1Ab הנקשרים לרצפטורים במעי האמצעי נחסמים ופעילות קוטלת-חרקים של הרעלן נמנעת. פפטידים 3 ו 6 (תרשים 2A) החסרים את רצף 67 חומצות האמינו של של פפטיד הTBR, לא בלמו את פעילות קטילת-החרקים של Cry1Ab (תרשים 5).

תרשים 3 בלימה תחרותית של קשירת רעלן Cry1Ab לTBR. ספציפיות ואפיניות של רעלן CRY הנקשר לTBR נקבעו ע"י ניתוח בלימה בתחרות בשימוש רעלן  Cry1Ab מיודד (מתוייג ביוד) הנקשר לפפטיד TBR מוכתם על רצועות ממברנת ניילון. קשירת רעלן מתוייג- רדיו (radiolabeled) נקבעה בנוכחות ריכוזים עולים של רעלן Cry1Ab בלתי-מתוייג. קבוע הניתון (dissociation constant)   K_d= 39nM) ) לאפיניות קשירת רעלן בוסס ע"י ניתוח קשר סקצ'רד (scatchard plot analysis) (1949).

3.7 פתולוגיה של רעלן Cry1Abבזחלי M.sexta.

עם כניסתו לגוף של חרק רגיש כגון תולעת קרן-הטבק רעלן הCRY של B.thuringiensis גורם להתפוררות (disruption) של המעי האמצעי של המוביל להפסקת תזונה ולמותו של הזחל. ההשפעה הכוללת של רעלן על תולעת קרן-הטבק מוצגת בתרשים 6. המעי האמצעי של תולעת קרן-הטבק (תרשים 6A) מרופד בתאי אפיתל עמודיים (columnar) (CC) שקצוותיהם מכילות microvillae (MV) ותאי גביע (goblet) (GC) רבים ששקועים באפיתל. חשיפה לרעלן Cry1Ab (תרשים 6B) משפיעה באופן קיצוני על השלמות המבנים של תאי הCC, גורם להם להתנפח ולאבד את הMV שלהם בתוך שעה למן ההרעלה. התהליכים גרמו בסופו של דבר לעיוות והתפוררות ממברנת CC והרס רקמת המעי האמצעי כולו. באופן מעניין, תאי הGC נראו כבלתי מושפעים מהרעלן. השפעת רעלן Cry1Ab על זחל שלם (תרשים 6C) הוא הפסקת אכילה, אובדן צבע (melanization) ומוות לאחר מספר ימים לאחר נוכחות הבקטריה בדם (sepsis). הזחל הנורמלי הבריא המשיך לגדול ולהתפתח ושמר על צבעו הירוק בהיר.

תרשים 4 בלימת קשירת רעלני  Cry1Ab לBBMV של M.sexta עם אנטי-סרום נוגד BT-R1 . BBMV (µg10) הודגרו עם רעלן Cry1Ab-¹²⁵I ( 0.32 nM) בנוכחות של ריכוזים עולים של או אנטי-סרום נוגד BT-R1 (עמודות כהות) או סרום טרום-אימיוני (pre-immune) (עמודות מפוספסות). קשירה בלתי-ספציפית נקבעה כתחום רדיואקטיביות בנוכחות µM 1 רעלן בלתי-מתוייג. כל נקודה מייצגת את ממוצע התוצאות משני ניסויים עצמאיים.

תרשים 5. בלימת פעילות קוטלת-חרקים של  Cry1Ab ע"י פפטיד הTBR. פעולה אנטגוניסטית של פפטיד הTBR על פעילות קוטלת-החרקים של רעלן  Cry1Ab נקבעה ע"י שימוש בביו-אסאי שרידות חרקים (insect survival bioassay) (ראה חלק 2). זחלים של  M.sexta בשלב ביניים מוקדם הוזנו בדיאטה המכילה רעלן Cry1A במינון LC₅₀ (7.5 ng/cm²) וריכוזים משתנים של פפטיד ה TBR (מעגלים סגורים) ופפטידי 3 ו 6 (מעגלים פתוחים) (תרשים 2A). הזחלים נוטרו למשך 72 שעות ותמותת חרקים תועדה. ניתוח לוגיסטי בוצע עם התוצאות הבאות: 0.0004= standard error (טעות סטנדרטית), odds ratio=1.00 (שיעור הסתברות), for intercept=6.48 X² (X ² בעבור בלימה),coefficient=6.31  X² for X₁ (X² למקדם X₁).

3.8 רעילות Cry1Ab לתאי COS- 7 טרנספקטים (transfected) cDNA  של BT-R1

בכדי לבסס קשר ישיר בין BT-R1 ורעילות לתאים ((cytotoxicity של Cry1Abהערכנו את השפעת רעלן Cry1Ab על תאי COS-7 טרנספקטים המבטאים BT-R1 . ביטוי BT-R1 על פני שטח של תאי COS-7 טרנספקטים וקשירת רעלן Cry1Ab לתאים הטרנספקטים ייוצגו ויזואלית ע"י מיקרוספקופיית אימינו-פלורצנטית עם שימוש בנוגדנים מתוייגים פלורצנטית (תרשים 7). תאים בכל הפנלים (panels) טופלו אנטי-סרום נוגד- BT-R1. תאים בלתי-טרנספקטים מוצגים בפנל A (תרשים 7) ללא רעלן Cry1Ab ועם רעלן בפנל B. תיוג רקע (background labeling) נצפה בתאים שטופלו עם אנטי-סרום BT-R1. תאים טרנספקטים עם cDNA של BT-R1 ללא רעלן Cry1Ab מוצגים בפנל D ועם רעלן בפנל E אחרי שעתיים ובפנל F לאחר ארבע שעות. כפי שניתן לראות בפנל D, תאים טרנספקטים הציגו    BT-R1 על פני השטח שלהם ובנוכחות רעלן Cry1Ab (פנלים E ו-F) איבדו את שלמותם המבנית. תאי חיקוי טרנספקציה (mock-transfected cells) שהכילו וקטור פלסמיד        pcDNA3.1 הראו הבדל ברור בנוכחות רעלן (תרשים 7, פנל C). יעילות הטרנספקציה והצגת BT-R1 על פני שטח התא הייתה 80% כפי שנקבע ע"י השוואת מספר התאים מתוייגי הפלורצנט למספר התאים הבלתי-מתוייגים ב100 שדות מיקרוסקופיים. השינויים המורפולוגיים הדרמטיים שנצפו בתאי הטרנספקטים עם BT-R1 (פנלים E ו-F) ארעו לאחר מספר שעות לאחר חשיפה לרעלן ובסופו של דבר הם מתו. תוצאות דומות הושגו כאשר תאי כלייה עובריים אנושיים (HEK 293) טרנספקטים עם cDNA של BT-R1 הודגרו עם רעלן Cry1Ab (נתונים אינם מוצגים). כשנלקחים ביחד, התוצאות מדגימות כי  BT-R1 מתווך ברעילות-לתאים באופן בלתי-תלוי-תא (cell-independent manner) כפי שהוסק מהשינויים המורפולוגים הבוטים ואובדן החיות לאחר שהוחדר רעלן Cry1Ab לCOS – 7 ההטרולוגי (heterologus) ותאי HEK 293  המציגים BT-R1.

4.דיון

מטרה נחשקת ביותר בפיתוח ושיפור מדבירי-חרקים מבוססי B.thuringiensis היא להחליף כמה שניתן מדבירי-חרקים כימיים מסוכנים. קביעת אינטראקציות רעלן-רצפטור עשוייה לסייע בהבנה של כיצד רצפטורי רעלן מעורבים בקידום רעילות ולסייע בתכנון חלבונים קוטלי-חרקים עם אפיניות גבוהה יותר וספציפיות גדולה יותר לחרקי המטרה. לרוע המזל, ישנן מעט ראיות ניסוייות בנוגע לאינטראקציה בין רעלני CRY והרצפטורים שלהם. אספקטים מסויימים של רעילות CRY לחלבון כגון אפקטים אוסמוטיים (של אוסמוזה, (osmotic effects, שלילת קוטביות ((depolarization והרס תאי אפיתל המעי האמצעי בחשיפה לרעלן אינם מובנים כראוי. גורמים שונים כגון מסיסות, התאמה, ביטוי, תפוקה  (yield) ומודיפיקציות פוסט-תרגומיות (post-translational modifications) הם שיקולים חשובים בקביעת התכונות המבניות והפונקציונליות של רצפטורי רעלן. לפיכך, הבהרת מבנה המולקולה וארגון רצפטורי הcadherin לרעלן Cry1A, BT-R1, הוא חיוני להבנה כיצד B.thuringiensisוהרעלנים שלו מטווחים תאים נשאים.

Cadherins הינם גורמים קובעים מרכזיים של תבנית התא בזמן התפתחות והם הכרחיים ליצירה ושמירת מבנה הרקמה בארגנימים רב-תאיים  (Nollet et al.,2000;Angst et al.,2001).  BT-R1 הוא cadherin אפיתלי המבוטא בזמן התפתחות הזחל של תולעת קרן-הטבק M.sexta. זה הוא סוג חדש cadherin אפיתל של חסרי-חוליות שמעורב ישירות באנטומופתוגניות של. B.thuringiensis מודל מבני מוצע בעבור BT-R1 המבוסס על הנוקלאוטיד (GenBank AF319973) ורצף חומצות האמינו המוסק מוצג בתרשים 8.  המודל מבוסס על ניתוח רצף חומצות האמינו של BT-R1 בשימוש בשרת ISREC ProfileScan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN). לפי המודל המתואר בתרשים 8 BT-R1 מורכב מארבעה אתרים ((domains: (i) EC; (ii) MPED ; (iii) TM ו- (iv) CYTO.  במורד רצף אותות ממברנה ((putative membrane signal sequence, הEC מורכב מחזרות של 12 cadherins העשויים יריעות β (β-sheets) הבנויים כמודולי EC (EC1 דרך EC12). הEC  מכיל זוג של שני רצפי הדבקות-תאים (cell-adhesion sequences) פוטנציאלים: HAV (His–Ala–Val), אופייני לכל ה-cadherins (Blaschuk et al.,1990) ורצף קשירת integrin  פוטנציאלי RGD ((Arg–Gly–Asp) שבדרך כלל נמצא בfibronectin (Ruoslahti and Obrink,1996 ;Yamada and Kennedy,1984 ;Pierschbacher and Ruoslahti,1987 ;D Souza et al.,1988 ;Ruoslahti,1996).

ל- EC של BT-R1 גם יש את מוטיב הפפטיד LDV אשר יושם בזיהוי integrin עם האתר המאוחה האלטרנטיבי (alternatively spliced domain) של fibronectin (Wayner et al.,1989 ;Mould et al.,1990 ;Komoriya et al.,1991 ;Tselepis et al.,1997). למרות שמוטיבי הרצף על BT-R1 לא בהכרח מסבירים אינטראקציות מולקולות ספציפיות, המצאות מוטיבי הכרה בלתי משתנים בעברו integrin עשויים להעיד על פונקציית אל-integrin (disintegrin) של BT-R1.  אולם, נוכחותם של מוטיבי רצף מדביק ((adhesive sequence motifs ברי הבחנה, הטיפוסיים למולקולת הדבקת-תאים, מצביעה על כך ש  BT-R1       הוא משטח חלבון הדבקה הטרופילי (heterophilic) שלו היכולת להקשר למולקולות cadherin אחרות כמו גם integrin. אין רצפי ברי-זיהוי על הCYTO בכדי להעיד על כך ש BT-R1          בא בקשרי-גומלין עם חלבונים תוך-תאיים (intracellular) כגון catenins (Nathke et al. ,1994).

תרשים 7. רעילות Cry1A לתאי COS-7 טרנספקטים עם cDNA של BT-R1. cDNA  באורך מלא המקדד את BT-R1 שובט לתוך וקטור הביטוי היונקי (של יונק)  pcDNA3.1 (Invitrogen) ובוטא בתאי COS-7 SV40 טרנספקטים של קוף אפריקני ירוק. ההשפעה של רעלן Cry1Ab בריכוז של  µg/ml0.6 במתווך התרבית הוערכה באופן אימיונוהיסטולוגי (immunohistologically) תוך שימוש במיקרוסוקפיה אפי-פלורצנטית ((epifluorescence microscopy של תאי BT-R1 לא-טרנספקטים, חיקוי-טרנספקציה (mock-transfected) וטרנספקטים. תמונות הופקו עם מיקרוסקופ אולימפוס מצוייד בעדשת Apochromat X40 ומצלמת אולימפוס SPOT תחת תאורה אפי-פלורצנטית. פנלים A ו-B: תאים לא טרנספקטים שטופלו באנטי-סרום כנגד BT-R1 (פנל A) ושטופלו עם רעלן Cry1Ab ואנטי-סרום כנגד BT-R1 (פנל B). פנל C: תאי חיקוי-טרנספקציה המכילים את וקטור הפלסמיד pcDNA3.1 בלבד טופלו ב רעלן   Cry1Abונוגדנים כנגד BT-R1. ביטוי של BT-R1 (פנל D) על תאים טרנספקטים עם cDNA של BT-R1 מזוהים ע"י נוגדנים כנגד BT-R1 מוצג ע"י נוגדנים משניים מתוייגי-TRITC. פנליפ E ו-F: תאים טרנספקטים עם cDNA של BT-R1 נחשפו לרעלן Cry1Ab למשך שעתיים (פנל E) וארבע שעות (פנל F) וטופלו באנטי-סרום כנגד BT-R1.

טבע מבנה וארכיטקטורת האתר של BT-R1 מוצגים בתרשים 8 יחד עם תבנית הביטוי הספציפית של הרקמה (Midboe et al.,2001), מצביעים במידה רבה על כך שהחלבון חשוב באירועי הדבקת (adhesion) תא-תא במעי האמצעי של החרק. ללא כל ספק, אינטראקציה של BT-R1 עם integrins, cadherins  אחרים או מולקולות קשורות ומעורבות בהתחברות (attachment) תאים ושמירת שלמות האפיתל הינם אספקטים חשובים לחקירה עתידית.

מעניין שרעלני Cry1A של B.thuringiensis מגייסים מולקולת הדבקת-תא (cell adhesion molecule) כמו BT-R1 בכדי לתקוף ולהרוס את החרק הנשא. הלימודים ההיסטופתולוגים של המעי האמצעי של M.sexta (תרשים 6) מראה כי הCC מתחילים להתנפח זמן קצר לאחר כניסת רעלן   Cry1Ab, מאבדים מבנה מיקרווילי (microvillar) ולבסוף מתפוצצים ומשחררים את תוכנם אל תוך חלל המעי האמצעי. תוצאות אלו תואמות את הדעה (Vadlamudi et al.,1995) שאנטומופתוגניות מתווכת ע"י קשירת רעלן Cry1Ab ל BT-R1על תאי אפיתל המעי האמצעי של M.sexta. המכניזם של ההרעלה, שייתכן וקשור בהתערבות בתפקוד BT-R1, ככל הנראה מביא לאובדן התחברות תא-תא והדבקות (adhesion) של תאים. בקיצור, קשירת הרעלן ל BT-R1מתחיל שרשרת אירועים שגורמת למספר תוצאות מנוגדות. באופן משמעותי, האירועים יכולים להחסם ע"י הפעילות האנטגוניסטית של TBR, מה שמבסס את הקביעה כי פתוגניות היא תוצאה של קשירת רעלן לרצפטור פני שטח המעי האמצעי, BT-R1.

הממצאים הנוכחיים והקודמים שלנו (Keeton et al.,1998) מראים שרעלני ,Cry1Aa Cry1Ab         ו-Cry1Ac נקשרים באופן ספציפי ועם אפיניות גבוהה ל. BT-R1 קשירת רעלן ארעה על TBR, אזור הממוקם בין חומצות אמינו 1296 ו- 1465 (פפטיד 6, תרשים 2(. ע"י שימוש בהצגת פאג (phage display) דיווחו גומז ושות' (Go´mez et al) (2001) על רצף פפטיד של שמונה חומצות אמינו (RITQTTNR) עם 71% דימיון לאזור (חומצות אמינו 873-880) בתוך פפטיד 3 (תרשים 2) מה שמציע את האפשרות שאינטראקציות רעלן-רצפטור עשויות לערב מספר קבועים מבניים (structural (determinants על שתי המולקולות. שום חלק של פפטיד הTBR הוא הומולוגי (זהה) להיות הרצף של שמונה חומצות האמינו שדווח ע"י גומז ושות' (2001) אפיטוד (epitope) קושר רעלן CRY ב- BT-R1 ובנוסף על כך, ניתוח קיצוץ (truncation) של BT-R1 לא חשף כל אינטראקצית רעלן בתוך הEC   הבלעדי של TBR (תרשים 2). רצף שמונה חומצות האמינו (,Go´mez et al2001) גם הוא חסר בTBR 284 חומצות האמינו של BtR₁₇₅ מ B.mori (Nagamatsu et al.,1999).

תרשים 8. מודל מבנה BT-R1. המבנה המוצע של רצפטור הcadherin BT-R1 מבוסס על האירגון-גוף האתר (domain organization) של סופר-משפחת החלבונים .cadherin BT-R1 בנוי מארבע אתרים: (i) EC, (ii) MPED, (iii) TM ו-(iv) CYTO. במורד רצף אותות הממברנה המוסכם, הectodomain מורכב מ12 חזרות cadherin שמובנות במודולי EC (EC11 עד EC12). הEC מכיל זוג רצפי הדבקת-תא (cell-adhesion), HAV (His–Ala–Val), המאופיין לכל הcadherins ושני רצפי קשירת-integrin, RGD    (Arg–Gly–Asp) וLDV (Leu–Asp–Val). אזור קשרית רעלן Cry1A נמצא בתוך ה EC11 שקרוב לMPED.

(4- המשך)

קשירת רעלן CRY התרחשה קרוב לMPED של BT-R1 אך לא חפף עם או רצף מוטיב הכרת הcadherin המוסכם (HAV) או עם שתי מוטיבים קושרי integrin (RGD וLDV). ייתכן ורעלני Cry1A מטווחים את אזור זה ומפריעים לאינטראקציות אלו ש BT-R1עשוי לקיים עם מולקולות פני-תא אחרות. בדרך אחרת, קשירת רעלני  Cry1A ל MPEDעל BT-R1 עשוייה למקם את הרעלנים קרוב לממברנות תאי אפיתל עימם הם יכולים לקיים יחסים ישירות (Promdonkoy and Ellar,2000). בכל מקרה, רעלני Cry1A קרוב לוודאי מטווחים מולקולות המעורבות באינטראקציות תא-תא ותא-מטריקס בתוך הנשא הרגיש לרעלן. Clostridium perfringens, בקטריית נבג גרם-פוזיטיב (spore-forming gram-positive bacterium) נוספת אופיינית לאדמה גורמת לזיהומים נישאי-אוכל בבני-אדם עם רעלנים התוקפים claudins בחיבורים הדוקים (tight junctions) באפיתל המעי של הנשא (Sonoda et al. ,1999 ;McClane ,2000). Bacteroides fragilis, הקשור מחלות שלשול, משתמש באנטרוטוקסין (רעלן רירית המעיים) בכדי לבקע את ה   E-cadherin בחיבורים הדוקים של אפיתל המעי של הנשא (Wu et al . ,1998). E.coli אנטרופתוגני (Enteropathogenic) משסע חיבורים הדוקים ע"י גיוס, ezrin, חלבון מקשר (linker protein) ממברנה-שלד התא (cytoskeleton) במארח שלו (Simonovic et al.,2001). לבסוף, Listeria monocytogenes, עוד פתוגן נישא-במזון, חוצה את מחסום המעיים ע"י אינטראקציה עם רצפטור הE-cadherin על פני שטח תא אפיתל, מקדם את כניסתו אל התאים נשאים (Cossart and Lecuit,1998 ;Lecuit et al.,2001). רעלן Zonula occludens (Zot) המופק בידי Vibrio cholerae מגדיל את החדירות של המעי הקטן של ע"י השפעה על מבנה החיבורים ההדוקים (tight junctions) הבין-תאיים (DiPierro et al) (2001). טיווח cadherins של הנשא ומולקולות חיבור תאים אחרות עשוי להיות מייצג בעבור בקטריות שמשבשות או מתחמקות ממחסומי אפיתלים בנשאים שלהן. ללא ספק, הפתוגניות של B.thuringiensis חולקת מכניזם(ים) משותף עם פתוגנים בקטריאלים אחרים שמטווחים את רקמות הנשא. רבות ממסגרות הקריאה הפתוחות (open reading frames) (ORFs) בפלסמיד הארס pXO1  של- B.anthracis מראים 80% ו98% דימיון לגנים של מינים מבודדים או קרובים של Bacillus, כולל B.cereus ו- B.thuringiensis (Pannucci et al.,2002). אולם, עוד נותר לקבוע האם ישנם מכנים משותפים בין B.thuringiensis, B.anthracis ו- B.cereus, שלהם דרגה גבוהה של קירבה גנטית (Helgason et al.,2000) ושהרעלנים שלהם מטווחים רצפטורי פני התא (Brossier et al.,2000 ;Hardy et al.,2001 ;Baillie and Read ,2001;Bradley et al.,2001). אף על פי כן, אנו מאמינים כי גיוס BT-R1 בידי B.thuringiensis בכדי להכריע נשא רגיש הוא מודל מערכת ללמידת פתוגנים בקטריאלים ולבחינת יחסים קו-אבולוציוניים בין חרקים ואנטומופתוגנים.

[1] שילוב רדיו-נוקליד של יוד לתוך חומר.